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天然小鼠補體C1q蛋白
更新時間：2021-03-10
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陽離子脂質(zhì)體傳統(tǒng)上用于傳遞遺傳物質(zhì)，例如各種類型的DNA（pDNA，cDNA，CpG DNA，寡核苷酸，反義寡核苷酸等），各種類型的RNA（例如siRNA，mRNA等）和核酸酸模擬物（NAM）。 將DNA封裝到常規(guī)的中性帶電荷的基于PC的脂質(zhì)體中可能是一個技術問題，主要是由于質(zhì)粒的大小。由于這個問題在80年代后期，已經(jīng)開發(fā)了由陽離子脂質(zhì)和PE組成的脂質(zhì)體。這個想法是用陽離子脂質(zhì)的正電荷中和pDNA的負電荷，以便主要由于靜電相互作用有效地捕獲更多質(zhì)粒并將其傳遞到細胞中。通常，該程序僅基于將陽離子脂質(zhì)體與DNA或RNA混合并將其添加到細胞中即可。這導致骨料的配方。
為了設計合適的陽離子脂質(zhì)用于基因傳遞，已將兩種方法用于陽離子脂質(zhì)合成：1）基于膽固醇的設計，例如DC-膽固醇和GL-67脂質(zhì)，以及2）非基于膽固醇的設計，例如作為DOTAB，DDAB和DOTMA。 為了使用脂質(zhì)體在體外成功轉(zhuǎn)移基因，應考慮一些因素： i）結(jié)合和包裝脂質(zhì)體中DNA / RNA的能力； ii）包裝的DNA / RNA與細胞表面的相互作用； iii）DNA / RNA內(nèi)在化的效率； iv）萬一發(fā)生內(nèi)吞作用，從內(nèi)體釋放細胞內(nèi)DNA； v）細胞核中的轉(zhuǎn)基因表達水平。 已根據(jù)其在酸性條件下釋放其含量的趨勢設計了對pH敏感的脂質(zhì)體。主要概念基于病毒，該病毒通過pH 5-6的蛋白質(zhì)與內(nèi)體膜融合，并在到達溶酶體之前將其遺傳物質(zhì)傳遞到細胞質(zhì)中。 通常，pH敏感脂質(zhì)體由二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）組成。由于磷脂酰乙醇胺（PE）在酸性條件下會發(fā)生變化，因此據(jù)信它可以充當膜融合促進劑。 脂質(zhì)體與細胞之間相互作用的有效性高度依賴于脂質(zhì)體組合物。脂質(zhì)體通過各種內(nèi)吞過程捕獲，效率取決于細胞類型和脂質(zhì)體大小。各種大小和電荷的脂質(zhì)體可通過吞噬作用附著于巨噬細胞和嗜中性粒細胞。脂質(zhì)體附著到細胞表面后，由于早期內(nèi)體的酸性更高（6.50），內(nèi)化進入內(nèi)體。通過成熟或囊泡融合將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到酸性更高的pH（5.5-6.0）的后一個內(nèi)體，這需要10-15分鐘。攝取后二十分鐘（或更長時間），內(nèi)含物被遞送至pH 5.0或更低的溶酶體。溶酶體是內(nèi)吞途徑中主要的降解和后的內(nèi)吞區(qū)段，pH不敏感的脂質(zhì)體在其中積累和降解。但是，在pH敏感脂質(zhì)體滲透到細胞中后，不會發(fā)生積累和降解。
有關上述脂質(zhì)體脂質(zhì)組成的更多信息，請單擊此處。
| 緩沖液和脂質(zhì)體大小 | 規(guī)格 |
|---|---|
| 緩沖 | 去離子無核糖核酸水 |
| pH值 | 7 |
| 脂質(zhì)體大小 | 100納米 |
| 熒光染料 | 激發(fā)/發(fā)射（nm） | 分子結(jié)構 |
|---|---|---|
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（7-硝基-2-1,3-苯并惡二唑-4-基）（銨鹽） | 460/535 |  |
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（lissamine羅丹明B磺酰基）（銨鹽） | 560/583 |  |
基于陽離子胺氮（在陽離子脂質(zhì)中）和DNA磷酸基團濃度計算正負電荷之比。DNA和RNA是核苷酸的聚合物。它們通過磷酸二酯鍵（一種特定類型的共價鍵）結(jié)合在一起，該磷酸二酯鍵可以長到數(shù)百萬個核苷酸。由于存在構成每個核苷酸的磷酸根基團（戊糖+含氮堿基+磷酸根），DNA和RNA帶負電。當形成磷酸二酯鍵的一部分時，它們保留2個負電荷中的1個。失去另一個負電荷以形成與新戊糖的另一個酯鍵。這就是將該鍵稱為“磷酸二酯”的原因。例如，陽離子脂質(zhì)DC-膽固醇具有以下結(jié)構。
DC-膽固醇具有兩個氮原子，但是靠近羧基的氮不是帶正電的。DC-膽固醇僅包含一個可質(zhì)子化的氮原子。因此，每個分子有一個正電荷。1 nmol的DC-膽固醇可貢獻1 nmol的正電荷。對于其他脂質(zhì)，請查看其分子結(jié)構以找到分子中的氮原子數(shù)。
RNA與DNA不同，是單鏈分子。但是，siRNA是雙鏈的。例如，在一個長21 bp的siRNA分子中，由于堿基對中有2個核苷酸，并且每個核苷酸帶有一個負電荷，因此存在42個負電荷。
1 µg DNA可產(chǎn)生3.1 nmol帶負電的磷酸鹽。
魚精蛋白是一種高度帶正電荷的聚陽離子肽，分子量為5.1 kDa，可作為DNA縮合試劑。已知魚精蛋白是精子核中用于濃縮DNA的主要成分。所有魚精蛋白都含有精氨酸，并且是強堿性的（等電點= 11-12）。
由脂質(zhì)魚精蛋白-DNA（LPD）組成的脂質(zhì)多聚體是通過魚精蛋白預壓縮的DNA與陽離子脂質(zhì)體的結(jié)合而產(chǎn)生的。這與通過陽離子脂質(zhì)和DNA之間直接靜電相互作用形成的陽離子脂質(zhì)體-DNA脂質(zhì)復合物相反。脂質(zhì)魚精蛋白-DNA具有凈正表面電荷，據(jù)信對于其與陰離子細胞表面蛋白聚糖的結(jié)合是*的。細胞表面的這種靜電相互作用觸發(fā)脂質(zhì)-DNA復合物的內(nèi)吞作用進入細胞。
向DNA和陽離子脂質(zhì)體中添加魚精蛋白的順序非常重要。一種方案涉及將質(zhì)粒DNA與硫酸魚精蛋白預復合，然后添加陽離子脂質(zhì)體。該協(xié)議有兩個缺點。其中之一是需要大量過量的陽離子脂質(zhì)才能實現(xiàn)大水平的基因表達。通常，陽離子脂質(zhì)/ DNA摩爾比必須大于35，才能有效體內(nèi)轉(zhuǎn)染。另一個問題是難以制備濃縮樣品。這是由于魚精蛋白硫酸鹽與質(zhì)粒DNA的強烈相互作用，這使得高濃度魚精蛋白/ DNA復合物的制備變得困難，尤其是在需要高魚精蛋白/ DNA比（w / w）的情況下。為了解決這些問題，已經(jīng)開發(fā)了第二種方案，其中將硫酸魚精蛋白與陽離子脂質(zhì)體混合，然后添加質(zhì)粒DNA。由于陽離子脂質(zhì)體和魚精蛋白之間競爭與質(zhì)粒DNA的相互作用，大大降低了魚精蛋白和DNA之間的強相互作用。在一定條件下，這將導致形成平均直徑小于150 nm的LPD。
為了計算正負比率，您需要考慮：
聚乙二醇化已在脂質(zhì)體學領域廣泛使用了數(shù)十年。聚乙二醇化的好處是*的，包括改善脂質(zhì)復合體的系統(tǒng)循環(huán)。然而，脂質(zhì)復合體的PEG化的缺點也已經(jīng)被很好地證明。這包括防止脂質(zhì)復合物與靶細胞締合以及抑制DNA從內(nèi)體區(qū)室釋放，這導致非常低的轉(zhuǎn)染效率。
隨著摻入陽離子脂質(zhì)體中的PEG化脂質(zhì)的分子量增加，陽離子脂質(zhì)體的細胞毒性增加。例如，含有PEG5000的脂復合物比含有PEG2000的脂復合物更具細胞毒性。陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染活性隨PEG-DSPE脂質(zhì)百分比的增加而降低。先前的研究表明，添加0.5％，1％和2％的PEG-PE分別將其活性降低至肺部原始熒光素酶活性的60％，40％和10％。還已經(jīng)報道將PEG-PE（1％的陽離子脂質(zhì)）添加到新形成的質(zhì)粒-脂質(zhì)體復合物中可以防止復合物在儲存期間聚集。但是，將含有PEG-PE的復合物在4°C下儲存會緩慢恢復其原始活性。一般來說，聚乙二醇化不用于轉(zhuǎn)染實驗。但是，特別是在某些實驗中體內(nèi)實驗使用聚乙二醇化脂復合物。
如果您需要進行涉及陽離子脂質(zhì)體聚乙二醇化的實驗，則強烈建議先將適量的遺傳物質(zhì)添加到脂質(zhì)體中，然后再在外部添加聚乙二醇化脂質(zhì)（插入后）并孵育脂質(zhì)體，以形成脂質(zhì)復合物。然后將PEG脂質(zhì)在高于陽離子脂質(zhì)的液相到凝膠相變溫度的溫度下放置一小時（如果是不飽和陽離子脂質(zhì)，例如DOTAP，則可以在室溫下孵育）。
在許多實驗中，由于不使用傳統(tǒng)的PEG2000-DSPE，而是使用C8-PEG2000-神經(jīng)酰胺對脂質(zhì)復合物進行PEG化，因為PEG-神經(jīng)酰胺是一種“脫落的PEG”，在與生物膜接觸時會從脂質(zhì)復合物中擴散出去。
由于脂質(zhì)體制劑中使用的陽離子脂質(zhì)具有細胞毒性，因此強烈建議進行細胞生存力分析。可以通過改良的Alamar藍分析法評估細胞活力。阿拉瑪藍含有氧化還原指示劑，該指示劑在細胞代謝的氧化還原范圍內(nèi)均顯示熒光變化。簡而言之，將10μL的10％（v / v）Alamar藍色染料添加到100μL樣品中。在37ºC下孵育2小時后，在熒光分光光度計上在570 nm和600 nm上讀取所得的熒光。使用以下公式計算細胞生存力（對照細胞的百分比）：
PlainGenesome®是由納米級單層脂質(zhì)體制成的白色半透明液體。FluorescentGenesome®制劑帶有顏色，其顏色取決于所用熒光染料的類型（有關外觀，請參見SDS）。通常由于脂質(zhì)體小，在小瓶底部不會發(fā)生沉淀。將脂質(zhì)體包裝在琥珀色的小瓶中。
當前位置：
